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Construction de séquences périodiques d’ADN : mesures de forces et détection de mutations
L’objet de la présente thèse est d’appliquer la construction de séquences
périodiques d’ADN aux micromanipulations de l’ADN et à la détection de
mutations. L’amplification enzymatique in vitro par HRCA (Hyperbranched
rolling circle amplification) est une technique s’inspirant de la
réplication circulaire utilisée par les bactéries pour la réplication des
plasmides. A l’instar de celle-ci la HRCA produit des ADN à séquences
périodiques.
Nous utilisons ce procédé dans la première partie de notre travail pour
concevoir des constructions moléculaires à séquences périodiques dédiées
au dégraffage de l’ADN. Nous avons commencé par modifier la HRCA afin de
pouvoir obtenir une molécule périodique insérable dans une construction de
dégraffage. Nous avons ensuite préparé des constructions d’ADN sur
lesquelles nous avons réalisé des mesures de forces à l’aide d’un double
piège optique.
Dans la seconde partie, la HRCA est adaptée pour permettre une détection
multiplexée de mutations sur puces à ADN ou transistors à effet de champ
(FET). Cette nouvelle technique que nous appellons tagged HRCA (THRCA)
permet la synthèse de molécules d’ADN à code-barres. Nous démontrons
d’abord que cette technique est rapide, sensible, sélective et adaptée au
multiplexage. Nous mettons ensuite en oeuvre un mode d’hybridation en
volume des produits de THRCA. Grâce au système de codes-barres, nous
sommes ensuite capables de caractériser la nature homozygote sauvage,
homozygote mutante ou hétérozygote du produit amplifié.